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  • 免疫(共)沉淀(IP/CoIP)試劑盒
  • 貨號: abs955
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    abs955-50tests 現貨 ¥2625.00
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    簡介:免疫(共)沉淀(IP/CoIP)是基于抗體和蛋白的特異性親和作用,通過捕獲與蛋白或抗原特異性結合的抗體,進而從復雜的樣品中捕獲及富集目標蛋白,同時可以測定與之相互作用的蛋白或其它生物大分子。
    實驗前:為了獲得更好的實驗結果,所有的步驟均需要根據實際情況進行優化。
    例如:根據細胞系或被捕獲的抗原后續用途的不同可選擇更加合適的細胞裂解條件。對于沒有細胞壁結構的哺乳動物細胞,可以直接使用去污劑進行裂解,但其它細胞,則需要一些機械剪切力輔助,例如超聲破碎。以下列出的(包括裂解液、孵育時間、體積及濃度)是作為初始嘗試的條件建議,最終的優化需要根據實際情況調整。
    另外,細胞裂解物在進行免疫(共)沉淀前,可先進行蛋白免疫印跡法檢測,以此來確定細胞裂解物里存在目標蛋白。
    一、試劑盒組分
    試劑名稱 體積 保存條件
    Lysis buffer 30ml 4 ℃
    10*Wash buffer 50ml 4 ℃
    1*SDS 樣品緩沖液 1ml 4 ℃
    Protein A 瓊脂糖珠 250ul 4 ℃
    Protein G 瓊脂糖珠 250ul 4 ℃
    ?注: Lysis buffer 使用前,立刻加入 1 mM PMSF(推薦購買abs9146,自行配制)。
    二、使用方法

    A. 制備細胞裂解物
    1. 吸干培養基。添加含有調節分子的新鮮培養基,使其在預定的時間內對細胞進行處理。
    2. 收集細胞,去除培養基后用冰預冷的 1 X PBS 洗滌細胞一次。
    3. 去除 PBS 并在每個細胞板上(10 cm)加入 0.5 ml 冰預冷的 Lysis buffer,并在冰上孵育至少5分鐘。
    4. 從板上刮下細胞,把提取物轉移至微量離心管。置于冰上。
    5. 在冰上進行 3 次超聲破碎,每次 5 秒。
    6. 在 4 °C,在 14,000 x g 條件下,微量離心10分鐘,將上清轉移到新管中。上清液即為細胞裂解物。如有必要,裂解物可保存在 -80 °C。
    注:細胞裂解物制備好之后,可先進行蛋白免疫印跡法檢測,以此來確定細胞裂解物里存在目標蛋白。
    B. 免疫沉淀法
    a) 細胞裂解物預清除(可選步驟)
    1. 向 500 μl(含總蛋白 200 -1000 ug)細胞裂解物中添加 5 μl Protein A 和 5 μl Protein G。
    2. 在 4 °C 下,旋轉孵育 30 - 60 分鐘。
    3. 4°C 條件下 12000g 離心1分鐘,保留上清,待用。
    b) 抗原抗體結合
    1. 在新的離心管內加入 500 μl (含總蛋白 200 – 1000 ug)細胞裂解物(可以是預清洗后的細胞裂解物)。
    2. 加入目標蛋白的單克隆/多克隆抗體(1 – 5 μg)。
    3. 同時采用非特異免疫的同源抗體作為對照。
    4. 在 4 °C 輕柔混合過夜。
    c) 免疫復合物沉淀
    1. 抗體孵育過夜后,加入 5 μl Protein A 和 5 μl Protein G。
    2. 在 4 °C 溫和地混勻1- 3小時或過夜。
    3. 3. 12,000 g 離心1 分鐘,保留沉淀。
    4. 使用 0.5 ml 1*Wash buffer 清洗沉淀,12,000 g 離心1分鐘,保留沉淀。
    5. 重復第4步,共計清洗3次。
    注:清洗,去上清的時候需要注意避免吸走填料
    C. 用蛋白免疫印跡法進行分析
    1. 在 20 - 40 μl 1*SDS 樣品緩沖液中重懸沉淀物,渦旋振蕩,然后再微量離心30秒,以使附著管壁的珠子和液體到管底。
    2. 將樣品加熱至 95 - 100 °C 并持續2 - 5分鐘,然后在 14,000 g下瞬時離心1分鐘,取上清液。
    3. 將樣品(15 – 30 μl)上樣到 SDS-PAGE 凝膠上。
    4. 用蛋白質印跡法分析樣品。
    三、試劑盒保存方法
    本試劑盒4℃保存,1年有效。

    溫馨提示:本產品僅作科研實驗使用,不支持臨床等研究
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    • 步驟上的可選步驟能否省略?
    • 該試劑盒是經過實驗驗證的, 在進行驗證實驗的時候實驗室都是要做這個可選步驟的, 建議不要省略,按照說明書操作。
    • protein A和protein G beads怎么選?
    • 各取5ul。
    • 超聲破碎冰上操作是必須的嗎?4℃條件能否微調?
    • 建議冰上操作,4℃可以微調。
    • beads出現吸不出來的情況,怎么處理?
    • 吸之前需注意槍頭要剪一下再吸,如若beads吸不上來,可加入等體積的20%乙醇混勻后再吸。
    • 如果沒有超聲破碎儀的話,能不能用酶解的辦法破碎細胞?
    • 酶解和超聲都可以,酶按照實驗室正常使用濃度配制即可。
    • 實驗的時候能抗體beads一起加嗎?還是說先加抗體再加beads?
    • 都可以,但我們建議參考產品說明書使用,先加抗體再加beads。
    • 10*Wash buffer如何稀釋?一定要使用配套的嗎?
    • dd水稀釋即可,最終濃度是1 * washing buffer 即可。
    • 怎么看出現的條帶結果?
    • 比較關注的是三條泳道,input和IgG以及檢測互相作用的泳道,理論上input有一條目的條帶, IgG沒有條帶。如果input沒有條帶,說明在進行免疫共沉淀之前沒有進行WB驗證,建議先驗證之后 再重新操作。若IgG陰性對照出現條帶,是不正常的,應是受重鏈和輕鏈的影響,說明使用的二抗 不正確, 建議更換特異性更強的二抗.
    • 免疫共沉淀試劑盒裂解液能用于組織嗎?比例又是如何?
    • 可用于組織,要先將組織研磨成勻漿,比例和細胞比例一致。
    • 陰性對照lgG組后續WB有條帶一般是什么原因?
    • 首先需要排除lgG和后續WB一抗同源導致的輕重鏈的干擾條帶(25kd和50kd附近);再者建議參考本試劑盒免疫沉淀法“可選步驟”以排除Protein A/G的非特異性結合;再就是考慮lgG的問題可以換用其他品牌lgG嘗試。

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